Preparación de muestras: Simplificando la Extracción en Fase Sólida

(1)

Preparación de muestras:

Simplificando la Extracción en Fase Sólida

(2)

Cuestiones previas

 Es imprescindible activar el sonido en su ordenador  Les recomendamos abrir la ventana del chat:

– Durante el webinario quizás les enviaremos algún mensaje por esta vía

– Si tienen preguntas las deben realizar por esta vía

 La presentación durará unos 45 minutos. Al final habrá tiempo

(3)

Agenda

 Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de

Muestras

 Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) – Introducción

a “Simple Prep”

 Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”  Conclusiones

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Retos actuales de la Industria

Retos empresariales

– Aumentar los beneficios

– Disminuir los costes

– Maximizar el uso de los recursos

Retos científicos

– Hacer más con menos

– Muestras/analitos diversos

– Dar resultados más rápidamente

Necesidades de los laboratorios hoy en día…

¿Cómo afrontar estas

necesidades?

(5)

Comparativa de distintas Técnicas de

Preparación de Muestra

Menor Sensibilidad Mayor

Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción Líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS)

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Técnicas de Preparación de Muestra:

Motivos para su elección

Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción Líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Solida (EFS) Opción simple Económica Rápida Reduce la complejidad de la muestra “Suficiente”

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Técnicas de Preparación de Muestra:

Percepciones

Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS)

La Precipitación de Proteínas

es “Simple”

La percepción de LLE & SLE es

que son técnicas “Simples”

La percepción de

la EFS es que es

una técnica

“Compleja”

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Técnicas de Preparación de Muestra:

Percepciones

Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS)

La Precipitación de Proteínas

es “Simple”

La percepción de LLE & SLE es

que son técnicas “Simples”

La percepción de

la EFS es que es

una técnica

“Compleja”

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Técnicas de Preparación de Muestra:

Un nuevo enfoque

Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción Líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS)

La EFS es percibida como una técnica “Compleja”:

Demasiadas etapas

Múltiples sorbentes disponibles Necesidad de desarrollar el

método

¿Podemos simplificar el proceso?

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Historia – Simplificando la EFS



Desde 1996, Waters ha intentado simplificar el

proceso de preparación de muestra mediante EFS

con sorbentes y protocolos genéricos

– Oasis HLB: introducido en el mercado en 1996 como el primer sorbente de EFS polimérico y humectable

– Sorbente de referencia en preparación de muestra durante los últimos 18 años

– Técnica de preparación de muestra de elección para análisis por LC-MS por la limpieza de sus extractos y su carácter

genérico.

– Tecnología de EFS conocida

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H

ydrophilic-

L

ipophilic

B

alanced

Copolymer

Sorbentes Oasis:

HLB

• Humectable

• Retención de polares

• Estable a todos los pH’s (1-14)

• Sin interacciones con silanoles

• Area superficial específica elevada (810 m2/g)

• Recuperaciones elevadas para ácidos, bases y neutros

Monomero Hidrofílico Monomero Lipofílico N O

Retención por Fase Inversa Retención de Polares

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Oasis HLB:

Importancia de la humectabilidad

Procainamide Acetaminophen (polar) Ranitidine Propranolol Doxepin % SPE R e c o v e ry

En sorbentes no humectables el secado de los poros tiene como resultado la no retención de los analitos en el paso de carga  recuperaciones bajas e irreproducibles

Con Oasis el secado del sorbente no impacta las recuperaciones

C18

(1cc/100mg)

HLB

(1cc/30mg) 0 20 40 60 80 100 0 4 8

Drying Time (minutes)

0 20 40 60 80 100 0 5 10

Drying Time (minutes)

Acetaminophen (Polar)

• Sorbente acondicionado con MeOH • Equilibrado con agua

• Secado durante tiempos distintos • Carga de la muestra

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Oasis HLB

Protocolo Genérico

Preparar la muestra Acondicionar/Equilibrar 1 mL metanol, 1 mL agua Carga de la muestra Lavar 1 mL 5% metanol/agua Eluir 1 mL metanol Evaporar, Reconstituir Oasis® HLB Protocolo EFS

(14)

¿Cómo se comportan otros sorbentes

poliméricos de EFS?

(15)

Recuperaciones (4 réplicas)

Comparativa

Competitor S Competitor S-X Competitor P Oasis HLB

(16)

Historia – Simplificando la EFS

 Introducción de los sorbentes de modo mixto: Fase inversa e

intercambio iónico

– Simplificar los métodos de preparación de muestra complejos con protocolos genéricos

– 2 Protocolos para 4 sorbentes: estrategia de 2x4

 Introducción de Ostro: preparación de muestras en modo

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Simplificando la EFS: preparación de

muestra en modo pass-through

Cargar la muestra Analitos de interés Retención de fosfolípidos Sorbente Ostro Retención de Proteínas

Los analitos pasan (pass-through)

(18)

¿Qué es Ostro?

 Ostro es una producto para la preparación de muestra diseñado

para eliminar las proteínas y los fosfolípidos presentes en la muestra gracias a una combinación de filtración e interaccción con el sorbente

 Beneficios:

– Muestras más limpias en menos tiempo

– Protocolo sencillo y genérico que elimina la necesidad de desarrollo de métodos

 Ostro proporciona métodos consistentes, robustos y rápidos

utilizando un protocolo simple y fácil de implementar

 Matrices y campos típicos de aplicación:

– Suero, plasma, sangre total, leche, tejidos y otras matrices que contengan proteínas y lípidos

(19)

Ostro: Campos de aplicación y

pretratamiento según matrices

Clínica / Toxicología sangre total

• Sangre total: lísis con Sulfato de Zinc Bioanálisis / Clínica Plasma/Suero • No necesario Alimentación Leche/Tejido • Extracción con acetonitrilo

(20)

Ostro: ¿Cómo funciona?

Clinica / Toxicología sangre total/plasma

• Sangre total: lísis con Sulfato de Zinc Bioanálisis Plasma/Suero • No necesario Alimentación Leche/Tejido • Extracción con acetonitrilo Cargar la muestra Añadir solvente Mezclar Analitos pasan Colectar & Inyectar

Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas, los fosfolípidos y el material particulado

(21)

Ostro en Toxicología:

Análisis de opiáceos en sangre total

 Los laboratorios de toxicología-forense requieren a menudo

analizar drogas en sangre total

 Muchas estrategias de preparación de muesta se han usado

para el análisis de sangre total

 Ostro representa una alternativa simple que permite realizar

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Ostro en Toxicología:

Protocolo de preparación de muestra

Añadir 150 μL de solución 0.1 M ZnSO4

/0.1 M NH4CH3COOH Añadir 50 µL of sangre total Mezclar (para lisar las células)

Añadir 600 µL de ACN Vortex

Pass through (vacío o presión positiva) Evaporar (N₂)

Reconstituir con 50 µL de 0.1% ácido fórmico en 2% acetonitrilo

(23)

Ostro en Toxicología: Recuperaciones

de opiáceos en sangre total

Ostro proporciona recuperaciones reproducibles

(24)

Removal of phospholipids from whole milk using Ostro

Ostro en Alimentación: análisis de

drogas veterinarias en leche

(25)

Agenda

Muestras

 Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) –

Introducción a “Simple Prep”

 Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”  Conclusiones

(26)

Introducción a “SIMPLE PREP”

¡ Convierta la preparación de muestra en algo

rápido y sencillo !

(27)

Formatos de Oasis:

 Carga típica: 250-1000 µL de muestra no diluida  Volumen de elución mínimo: alrededor de 200 µL  Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar  Carga típica: 25-375 μL de muestra no diluida (=50-750 µL de muestra diluida)

 Volumen de elución mínimo: 25 μL

 Evaporación y reconstitución no necesarias para concentrar

Placa convencional Placa µElution

 Carga típica: 0,5-1000 mL de muestra  Volumen de elución mínimo: alrededor de 0,5 mL  Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar Cartuchos

(28)

Placa Oasis µElution

 Diseñada para la limpieza y la concentración en fluidos biológicos  Contiene 2 mg/pocillo de sorbente Oasis para la extraccíón de una

amplia gama de compuestos ácidos, básicos y neutros

 Ideal para aquellos usuarios con volumenes de muestra reducidos

(< 200 µL)

 Permite la elución con <50 µL, pudiendo concentrar hasta 15

veces los analitos sin evaporación ni reconstitución

 Compatible con la mayoría de sistemas robóticos de manejo de

líquidos de alto rendimiento, tanto por vacío como por presión positiva

 Uniendo el diseño específico de la placa con las excelentes

propiedades del sorbente Oasis HLB podemos llevar la EFS a un nuevo nivel de simplicidad, no posible en la inmensa mayoría de otros sorbentes/formatos:

– Protocolo con 3 únicos pasos: Carga-Lavado-Elución

– Sin necesidad de Acondicionar y Equilibrar ni de Evaporar y Reconstituir

Diseño Patentado Compatible con el

diseño estándard ANSI

(29)

Protocolo EFS estándard con µElution

Acondicionar • 200 µL Metanol (MeOH) Equilibrar • 200 µL H₂O Lavado • 200 µL 5% MeOH en H₂O Elución • 25 µL*2 MeOH Carga

• 200 µL plasma diluido y dopado

(100 µL plasma+100µL 4% H₃PO₄) 100 µL Plasma _{5 µg/mL}

Eluato

10 µg/mL

(30)

Protocolo EFS estándard con µElution

Eliminacion de estos pasos Acondicionar • 200 µL Metanol (MeOH) Equilibrar • 200 µL H₂O Lavado • 200 µL 5% MeOH en H₂O Elución • 25 µL*2 MeOH Carga

(31)

Comparativa de protocolos Oasis

µElution: Estándard vs. Simplificado

Acondicionar Equilibrar Lavado • 200 µL 5% MeOH en H₂O Elución • 25 µL*2 MeOH Carga

(100 µL plasma+100µL 4% H₃PO₄)

• 200 µL Metanol (MeOH) • 200 µL H₂O

• 200 µL 5% MeOH en H₂O

• 25 µL*2 MeOH

(100 µL plasma+100µL 4% H₃PO₄)

 Inyección directa del eluato

 Evaluación de recuperaciones, variabilidad, efecto matriz y limpieza del extracto

(32)

Agenda

Muestras

a “Simple Prep”

 Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”  Conclusiones

(33)

Evaluación del Protocolo Simplificado

 Comparar los protocolos estándard y simplificado

– Recuperaciones, Efecto Matriz y limpieza del extracto

 Validación del protocolo simplificado

– Reproducibilidad lote a lote (años 2005 -2013) – Capacidad de carga de plasma

 Comparitivas:

– Otras matrices: orina

– Otros formatos: placas de 10mg y cartuchos de 30mg

– Otros sorbentes: Oasis HLB vs. sorbentes C18 de base sílice y poliméricos

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Condiciones LC de las pruebas

Instrumento ACQUITY UPLC I class - _{Xevo TQ-S}

Columna UPLC 1.7 µm CSH C18, 2.1 x 100mm Temperatura Columna 40°C

Temperatura Muestra 10°C Tiempo de cromatograma

(Caudal) 7 minutes (0.5 mL/min) Fase Móvil A: Agua con 0.1% ácido fórmico Fase Móvil B: ACN con 0.1% ácido fórmico Solventes de limpieza

(Strong y Weak) 70/30 ACN/agua con 2% ácido fórmico

Seal wash 10% MeOH

Detección MS: Xevo TQ-S Condiciones MS ESI+ MRM

CSH: Charged Surface Hybrid

(35)

Analitos

Name pKa Log P Comments

1B Azidothymidine (AZT) 9.68 0.05 Antiretroviral drug for HIV/AIDS 2B 7-Hydroxycoumarin 7.8 1.6 Gradient in sunscreen, absorb UV 3A Phenacetin 2.2 1.6 Pain, fever reducer

4N Betamethasone -- 1.1 Anti-inflammatory and _{immunosuppressive}

5B Protriptyline 8.2 4.4 Antidepressant

6A Alprazolam 2.4 4.9 Panic and anxiety disorders 7B Amitriptyline 9.7 4.8 Antidepressant

8A Naproxen 4.2 3.2 Pain, fever reducer 9B Propranolol 9.5 2.5 Hypertension

 Drogas para distintas campos de aplicación

(36)

Recuperaciones con muestras plasmáticas:

protocolo estándard vs. Simplificado

Protocolo de 5 pasos vs. protocolo de 3 pasos: Recuperaciones y desviaciones estándard

comparables Recuperaciones medias >90% y RSDs <5% ) dopada -post muestra de Respuesta extraída muestra de Respuesta ( 100 ón Recuperaci = ×

Recuperaciones

0 20 40 60 80 100 120

AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox AVG

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Factor de matriz (MF):

Protocolo estándard vs. simplificado

* Bioanalytical Method Validation Guide de la European Medicines Agency, 2012

blanco en Respuesta matriz en Respuesta MF =*

Protocolo estándard Protocolo simplificado Matrix factor 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 Procain N -

acety AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox

Factores de Matriz equivalentes con ambos protocolos (MF de 1.00±0.15 obtenidos con el protocolo simplificado

(Carga-Lavado-Elución) )

Factor de Matriz:

1.0 = no hay efecto matriz >1.0 = ion enhancement

(38)

Limpieza del extracto:

Comparativa

No se observan diferencias en el test de limpieza por MS entre el protocolo de 5 pasos y el de 3 pasos (Carga-Lavado-Elución)

Cromatogramas LC/MS obtenidos usando un Xevo TQ-S

Referencia: MeOH

Extractos con el protocolo simplificado

Extractos con el protocolo estándard

ESI+ MS scan 50-650

(39)

Protocolo Simplificado:

Capacidad de carga de muestra

La capacidad de carga se mantiene constante en los distintos volumenes

La capacidad de carga evaluada fue entre 25 y 375 µL de plasma

Recuperacciones entre 80 - 110% con RSDs inferiores al 5% para todos los analitos 0 20 40 60 80 100 120

Diferentes volumenes de plasma cargados

(40)

Protocolo Simplificado:

Reproducibilidad lote a lote

Recuperaciones muy consistentes entre todos los lotes Cuatro lotes diferentes de Oasis HLB seleccionados entre 2005 - 2013

Recuperaciones medias entre todos los lotes: 90±6%

0 20 40 60 80 100 120

(41)

Veamos ahora cómo se comportan las

muestras de orina

(42)

Protocolo Simplificado vs. Estándard:

Evaluación de fármacos en orina

Recuperaciones y Factores Matriz comparables

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox

0 20 40 60 80 100

Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox

Protocolo estándard Protocolo simplificado

Recuperaciones

Matrix factor

Protocol estándard Protocolo simplificado

Muestras de orina diluidas 1:1 con 100 mM acetato sódico pH 5.0

(43)

¿Podemos aplicar esto a otros sorbentes?

¿Y a otros formatos (cartuchos o placas

(44)

Protocolo Simplificado:

Comparativas

 Comparativas realizadas:

– Placas µElution, placas de 10mg y cartuchos – Oasis HLB vs. sorbente C18 de base sílice – Oasis HLB vs. otros sorbentes poliméricos

 En las distintas comparativas nos centramos en 2 parámetros

– Recuperaciones – Efecto matriz

(45)

Protocolo Simplificado:

Cartuchos Oasis HLB 1cc/30 mg

 Comparable (high) recoveries and (low) matrix effects with

plasma when comparing 5-step protocol versus simplified 3-step (Load-Wash-Elute) protocol

Recuperaciones (elevadas) y efectos matriz (bajos) comparables entre el protocolo de 5 etapas y el de 3 (Carga-Lavado-Elución)

(46)

Protocolo Simplificado vs. Estándard:

Cartuchos Oasis HLB 1 cc/30 mg

 Recuperaciones comparables entre los dos protocolos

(47)

Oasis HLB µElution vs. C

₁₈

de base sílice

µElution; Protocolo Simplificado

Únicamente HLB da buenos resultados trabajando con el protocolo simplificado de 3 etapas, tanto para plasma

como para orina

Con el sorbente C₁₈ de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas 0 20 40 60 80 100

Plasma

Oasis HLB Silica-based C₁₈

Orina

0 5

(48)

Oasis HLB vs Sorbentes poliméricos

similares; plasma - 4 réplicas

0 20 40 60 80 100 120

Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP

AZT 7 - Hydroxycoumarin Phenacetin Betamethasone Protriptyline Alprazolam Methoxyverapamil Terfenadine

Oasis AVG Recovery: 100% Oasis AVG RSD: 1%

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Comparativa de Efectos Matriz

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80

Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP

AZT 7 - Hydroxycoumarin Phenacetin Betamethasone Protriptyline Alprazolam Methoxyverapamil Terfenadine blank in Response matrix in Response MF=

Con Oasis HLB se obtienen los efectos matriz más bajos (mejores resultados)

Factor Matriz:

1.0 = efecto matriz inexistente >1.0 = ion enhancement

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Conclusiones de las comparativas con

otros sorbentes

 El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) únicamente

funciona con Oasis HLB (un sorbente 100% humectable)

 Con un sorbente C18 de base sílice se obtienen recuperaciones

muy bajas

 Con sorbentes poliméricos similares se obtienen recuperaciones

(51)

Próximos pasos: Protocolos simplificados

para modos mixtos

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Protocolo Simplificado para Oasis MCX:

Screening toxicológico en orina

(53)

Screening Toxicológico en orina

Resultados

 Sistema LC: Acquity I-Class

 Columna: BEH Ph 2,1x100mm 1,7µm  Detector: Xevo TQD

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Agenda

Muestras

a “Simple Prep”

 Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”  Conclusiones

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Conclusiones

 El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) para Oasis HLB

permite:

– Mejorar el flujo de trabajo reduciendo los pasos del método de extracción en fase sólida de 5 a 3

– Reducir alrededor de un 40% el tiempo de procesado, así como ahorrar una media del 70% en solventes

– Obtener recuperaciones elevadas, baja variabilidad y efectos matriz bajos

– Compatible con muestras plasmáticas y de orina

– El protocolo funciona tanto para placas como para cartuchos Oasis – Los resultados de aplicar el protocolo simplificado a otros sorbentes

(C18 base sílice y poliméricos) son claramente peores

– Trabajando con la placa µElution se puede cargar entre 25 y 375 µL de muestra y concentrar los analitos hasta 15x

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Gracias

 A continuación de este webinario:

– Recepción

o Presentación en PDF

o Application Notes relacionadas

• 720005140EN • 720005290EN • 720005053EN • 720004673EN

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o Soporte Técnico Waters: 902 254 254

o [email protected]

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Agradecimientos

 Frank Marszalkowski  Doug McCabe  Chris Poz  Mary Lame  Pamela Iraneta  Xin Zhang  Euan Ross  Erin Chambers  Kenneth Fountain  Gregory Lawless

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