Efecto de la oxidación por peróxido de hidrógeno sobre la actividad gabaérgica en el nemátodo caenorhabditis elegans.

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(1)

Instituto Tecnológico de Colima

Dirección General de Educación Superior Tecnológica

Institutos Tecnológicos SEP

R

P R E M I O INTRAGOB

2006

a la

(2)
(3)
(4)

ÍNDICE

Introducción

3

Justificación

5

Objetivos

6

Caracterización del Área

7

Problemas a Resolver

8

Alcances y Limitaciones

8

Fundamento Teórico

9

Procedimiento y Descripción de Actividades

17

Resultados

25

Conclusiones y Recomendaciones

27

(5)

INTRODUCCIÓN

El Caenorhabditis elegans (C. elegans) se considera como un modelo animal

altamente distinguido que proporciona un sistema manejable para los estudios de

genética, función celular, neurobiología, diferenciación y desarrollo. Se utiliza en este

proyecto por ser modelo de alto rendimiento con resultados en corto plazo de tiempo, al

igual que por su sistema nervioso bien definido.

El estrés oxidativo se conoce como un desbalance en el equilibrio pro-oxidantes y

antioxidantes, siempre en favor de los pro-oxidantes. Se encuentra asociado a toda una

serie de patologías de curso crónico e invalidantes, entre las que se encuentran

enfermedades neurodegenerativas como la epilepsia y trastornos como la ansiedad y el

insomnio, relacionadas con la actividad GABAérgica.

En este proyecto se utilizó como agente pro-oxidante al peróxido de hidrógeno y a

la curcumina como agente antioxidante (conocida por sus propiedades antiinflamatorias),

completando así el balance de estrés oxidativo.

El neurotransmisor más abundante en el cerebro es el ácido -amino butírico

(GABA), y éste aminoácido parece ser uno de los neurotransmisores principales,

controlando la función neuronal. Por ende, si existiera algún cambio en concentración

dentro del cerebro se producirá una alteración en la función celular. GABA también es un

importante neurotransmisor en C. elegans. En contraste a vertebrados donde GABA actúa

en las sinapsis del sistema nervioso central, en nemátodos GABA actúa principalmente en

sinapsis neuromuscular. Específicamente, éste neurotransmisor actúa para relajar los

músculos durante la locomoción, el forrajeo y para contraer los músculos durante la

defecación. La importancia de este neurotransmisor para las funciones básicas motoras

del Caenorhabditis elegans es crítica al momento de analizar el daño ocasionado por

estrés oxidativo.

(6)

inhibitorio en invertebrados y vertebrados. En este sentido, el objetivo de este trabajo es

evaluar el efecto del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno (H202) sobre el

Sistema GABAérgico utilizando el modelo animal C. elegans, un nemátodo de vida libre

utilizado recientemente en estudios sobre estrés oxidativo.

En particular, la actividad GABAérgica es necesaria para la observación de

conductas estereotipadas como la respuesta al toque a la nariz (RTN).En este trabajo se

analiza esta conducta después de someterlos a estrés oxidativo con H202, GABA y

(7)

JUSTIFICACIÓN

Se evaluó la actividad GABAérgica dentro del nemátodo C. elegans sometiéndolo a

estrés oxidativo, ya que existe la teoría de que éste está asociado con las especies

reactivas de oxígeno (que reaccionan con sustratos endógenos celulares causando daños

irreversibles y muerte) y que podría ser mejorado por intervenciones que realcen la

resistencia al estrés oxidativo.

Someter C. elegans a estrés oxidativo y observar su respuesta al toque de nariz

indica si se induce un deterioro en el sistema GABAérgico. Al someterlo junto con un

antioxidante, nos indicará si la co-exposición revierte el efecto de oxidación,

comprobando que el deterioro es dependiente del receptor GABA. Mencionado

anteriormente, el receptor GABA se encuentra asociado con varias enfermedades

neurodegenerativas como la epilepsia, Alzheimer, Huntington, Parkinson, atrofia

muscular, y esclerosis múltiple.

A largo plazo, este estudio serviría como un principio para encontrar un vínculo

entre el deterioro por parte de la oxidación en el receptor GABA y las enfermedades

(8)

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno (H202)

sobre el sistema GABAérgico utilizando el modelo animal Caenorhabditis elegans.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Investigar los métodos y protocolos específicos que se necesitan para

trabajar con C. elegans.

 Búsqueda bibliográfica acerca del C. elegans para una mejor preparación al

momento de experimentar con los nemátodos.

 Aprender protocolo de mantenimiento de nematodos.

 Aprender a preparar los medios y fármacos específicos para el

mantenimiento de nemátodos y los experimentos a realizar.

 Aprender a realizar experimentos científicos necesarios para tener datos

(9)

CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO

El Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS) en Guadalajara, Jalisco, es

uno de los seis centros temáticos por parte de la Universidad de Guadalajara destinado a

ciencias referentes a la salud. El presente proyecto se desarrolló en el laboratorio de

neurofisiología, en el departamento de Fisiología a cargo del Dr. Leonardo Hernández.

El Departamento de Fisiología es la instancia universitaria cuyas academias,

institutos, laboratorios y cuerpos académicos contribuyen a la formación de recursos

humanos en pregrado y posgrado en el área de salud a través del estudio de la estructura

y función biológica del individuo sano y enfermo mediante el desarrollo de actividades de

docencia, investigación y asistencia en el campo de la Biología Molecular, Bioquímica,

Genética, Inmunología, Farmacología, Fisiología y Fisiopatología (CUCS, 2006).

El laboratorio de neurofisiología cuenta con estrés oxidativo celular, evaluación de

efectos de la curcumina y neurotoxicidad como principales líneas de investigación. Dentro

del laboratorio se llevaron a cabo actividades como el protocolo de mantenimiento de

nemàtodos y preparación de soluciones específicas (FIG.1) para los experimentos

utilizando equipos específicos como incubadoras, centrífugo, microscopios y autoclaves.

(10)

PROBLEMAS A RESOLVER, PRIORIZANDO

 Determinar concentraciones y cantidades óptimas de fármacos para los

nemátodos.

 Determinar el tiempo de exposición de cada fármaco para lograr una curva

experimental de supervivencia en nemátodos.

 Establecer una metodología precisa para evaluar el efecto oxidativo en nemátodos.

 Establecer una guía de conductas aceptables y no aceptables para la respuesta al

toque de nariz (RTN).

ALCANCES Y LIMITACIONES

Los alcances establecidos en este proyecto fueron al determinar las

concentraciones adecuadas de fármacos oxidativos y los tiempos de exposición para

estos, ya que en base a eso el proyecto llega a conclusiones más concretas sobre el

impacto de la oxidación en el sistema GABAérgico del C. elegans.

Las limitaciones para realizar este proyecto fueron 2. La primera limitación fue por

parte del tamaño del laboratorio, que nos limitaba el espacio entre 5 personas para hacer

diferentes actividades a la vez, así como el uso de material y equipos compartidos entre

todos los participantes en el laboratorio. La segunda limitación fue por parte de la

fragilidad del organismo C. elegans, ya que son propensos a morir si las concentraciones a

las que se expone son mayores a 0.5mM o el tiempo de exposición dentro de la centrífuga

(11)

FUNDAMENTO TEÓRICO

Caernorhabditis elegans

FIG. 2: El nemátodo Caenorhabditis elegans a microscopio.

El nemátodo Caernorhabditis elegans se empezó a utilizar como modelo animal

fundamental para estudios biológicos desde 1964 gracias a Sydney Brenner (Wood, 1988).

Éste nemátodo tiene varias cualidades indispensables para la realización de este proyecto:

 Un ciclo de vida muy corto de 2-3 semanas.

 Modelo de alto rendimiento con resultados en corto plazo de tiempo.

 Producen grandes cantidades de descendencia por reproducción sexual.

 Pueden cultivarse fácilmente en el laboratorio y por ende su mantenimiento

también es fácil.

 Transparente, lo que facilita observarlo en el microscopio.

 60% a 80% de los genes causantes de enfermedades en humanos, tienen

ortólogos muy cercanos al genoma de los nemátodos.

 Cuenta con sistema nervioso y digestivo bien definidos; el sistema nervioso de los

adultos hermafroditas cuenta con 302 neuronas, de las cuales 20 son neuronas del

(12)

Es pequeño (alrededor de 1 mm de longitud), transparente para facilitar la

manipulación y la observación, se alimenta de bacterias como E. coli, su cultivo en grandes

cantidades (hasta 10,000 nemátodos/Caja Petri) es sencillo y económico. C. elegans tiene

cinco pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales. Tiene dos sexos (FIG. 3),

machos y hermafroditas (Wood, 1988).

FIG.3: Representación de los dos sexos de C. elegans.

En la naturaleza, hermafroditas son el sexo más común. Además, C. elegans es

extremadamente fértil, una hermafrodita puede producir unos 300 a 350 crías bajo

autofecundación. Estos rasgos hacen que le sea fácil producir numerosos genotipos y

(13)

FIG.4: Ciclo de vida de C. elegans.

Además, tiene un corto ciclo de vida (FIG 4). Su vida útil es de alrededor de 2 a 3

semanas bajo condiciones de vida adecuadas. Comparado con el uso de otros organismos

modelo, tales como ratones, el corto ciclo de vida del C. elegans reduce el ciclo

experimental y facilita el estudio biológico (Donald, 1997; Kenyon, 1988; Wood, 1988).

Sistema GABAérgico (Receptor GABA)

Es sabido que el aminoácido acido γ-amino butírico (GABA) es el mensajero

químico de tipo inhibidor más abundante en el sistema nervioso central, sugiriéndose que

el 30 o 40% de las neuronas del cerebro utilizan GABA como neurotransmisor. Su

existencia en el tejido nervioso garantiza el equilibrio entre excitación e inhibición

neuronal, un requisito fundamental en la función sensitiva, cognitiva ymotora. De lo

anterior, es válido pensar que las alteraciones en la función GABAérgica son el sustrato

fisiológico para el desarrollo de diversos trastornos neurológicos y psiquiátricos. Las

(14)

enfermedad de Parkinson, la demencia senil, la enfermedad de Alzheimer y la

esquizofrenia (Cortés-Romero et al, 2013).

Existen diferentes tipos de receptores de GABA, como se observa en la figura 5.

Unos de acción rápida, receptores ionotrópicos GABA-A y GABA-C; y otros de acción lenta,

los receptores metabotrópicos GABA-B. El receptor GABA-A, situado en la membrana

plasmática del terminal post sináptico, es el que se relaciona con los receptores de los BZD

(benzodiazepínicos). Por su parte, los receptores GABA-B y GABA-C, ubicados en la

membrana plasmática de los terminales pre y post sinápticos, no tienen relación con

(15)

Los receptores GABA-A abren canales de cloro y son por lo tanto inhibidores de la

conducción del impulso nervioso. Los receptores GABA-A son el sitio de acción para el

principal neurotransmisor inhibidor del cerebro, además de que interaccionan con

numerosos fármacos de uso clínico con propiedades ansiolíticas, anti convulsionantes,

músculo relajantes y sedativas. La estructura primaria del receptor GABA-A revela que es

miembro de una superfamilia de canales iónicos activados por ligando, que incluye a los

receptores nicotínicos para acetilcolina, receptores ionotrópicos para glutamato, glicina y

serotonina (Cortés-Romero et al, 2013).

En los receptores GABA-B es la permeabilidad de K+ la que aumenta y transmiten la

señal por medio de segundos mensajeros. Actualmente, el empleo de moduladores

alostéricos del receptor GABA-B ha sido relevante en estudios dirigidos al tratamiento de

trastornos neurológicos y psiquiátricos. Los receptores metabotrópicos GABA-B son

heterodímeros con localización pre y postsináptica, donde inhiben la liberación de

neurotransmisor y provocan la hiperpolarización, respectivamente. Poseen importantes

sitios de modulación alostérica, potencialmente útiles para la clínica. Están asociados a

proteínas G (Cortés-Romero et al, 2013).

Aunque GABA reconoce ambos tipos de receptores, existen agonistas de GABA

que sólo reconocen uno de los dos. Este hecho permitió diferenciar los dos tipos de

receptores para GABA. Por ejemplo; el baclofén (Beta-p-Cloro fenil GABA), un análogo del

GABA, es inactivo en los receptores A, pero activo en los receptores

GABA-B(Cortés-Romero et al, 2013).

Los receptores GABA-A forman canales de cloro que están formados de varias

subunidades. Gracias a los avances recientes en la clonación molecular, se ha logrado

determinar que los receptores GABA-A contienen múltiples subunidades de receptores

µ5. Los receptores µ5 son receptores muscarínicos de la acetilcolina que también son

miembros de la familia rodopsina. Juegan varios roles importantes; ellos moderan muchos

de los efectos de la acetilcolina en el sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso

(16)

respiratorias, ojos y contracción del músculo liso intestinal, frecuencia cardíaca y

secreciones glandulares. Los receptores tienen una distribución generalizada del tejido y

son un objetivo importante de drogas en las enfermedades humanas. Pueden ser eficaces

dianas terapéuticas en la enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia, enfermedad de

Parkinson y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Eglen, 2005; Wess, Eglen,

Gautam, 2007).

Asimismo, se ha sugerido que los múltiples receptores GABA-B son responsables

de varias funciones metabotrópicas en el cerebro para la transmisión inhibitoria gracias a

su acoplamiento con proteínas de unión GTP (Cortés-Romero et al, 2013).

La molécula de GABA presenta una flexibilidad conformacional, debido a que sus

enlaces internos son capaces de rotar libremente, por lo que distintos estados

conformacionales de la molécula pueden activar distintos receptores GABA de manera

diferencial (Cortés-Romero et al, 2013).

Estrés Oxidativo

El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción de especies

reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rápidamente

los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. Todas las formas de vida

mantienen un entorno reductor dentro de sus células. Este entorno reductor es

preservado por las enzimas que mantienen el estado reducido a través de un constante

aporte de energía metabólica. Desbalances en este estado normal redox pueden causar

efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libres que dañan a todos

(17)

beneficiosas ya que son utilizadas por el sistema inmune como un medio para atacar y

matar a los patógenos. Las especies reactivas del oxígeno son también utilizadas en

la señalización celular(SER, 2010).

En términos químicos, el estrés oxidativo es un gran aumento (cada vez más

negativo) en la reducción del potencial celular o una gran disminución en la capacidad

reductora de los pares redox celulares como el glutatión. Los efectos del estrés oxidativo

dependen de la magnitud de estos cambios, si la célula es capaz de superar las pequeñas

perturbaciones y de recuperar su estado original. Sin embargo, el estrés oxidativo severo

puede causar la muerte celular y aún una oxidación moderada puede desencadenar la

apoptosis, mientras que si es muy intensa puede provocar la necrosis(SER, 2010).

Un aspecto particularmente destructivo del estrés oxidativo es la producción de

especies de reactivas de oxígeno, que incluyen los radicales libres y los peróxidos. Algunas

de las menos reactivas de estas especies (como el superóxido) pueden ser convertidas por

una reacción redox con metales de transición u otros compuestos de ciclo redox en

quinonas, especie radical más agresiva que puede causar extenso daño celular(SER, 2010).

La mayoría de estas especies derivadas del oxígeno se producen en un nivel bajo

en condiciones normales de metabolismo aeróbico, y el daño que causan a las células es

reparado constantemente. Sin embargo, bajo los niveles graves de estrés oxidativo que

causan la necrosis, el daño produce agotamiento de ATP impidiendo la muerte celular por

apoptosis controlada, provocando que la célula muera liberando al medio numerosos

compuestos citotóxicos (SER, 2010).

Respuesta a Toque de Nariz

Es simplemente una conducta estereotipada que permite observar la función

(18)

“picker”, que es una herramienta con un pelo de ceja con la cual se dispone a tocar a los

organismos en el área de la cabeza o la nariz (FIG. 6).

A. B.

FIG. 6: Se observa de A la respuesta normal de C. elegans al toque a la nariz y de B se observa la

(19)

PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS

Parte Medular

ACTIVIDAD PROCEDIMIENTO

PROTOCOLO DE MANTENIMIENTO DE

CEPAS DE NEMÁTODO C. ELEGANS (FIG. 7)

Se movían 5 gusanos adultos a una caja

nueva con bacteria OP50-1.

Posteriormente se movía un “chunk”

(pedazo de agar con C. elegans vivos

adultos) a caja nueva con bacteria OP50-1.

FIG. 7: Protocolo de mantenimiento de cepas de C. elegans, dónde se movían 5 gusanos adultos

con ayuda del “picker” a una caja nueva mediana con bacteria E. coli no patógena y un pedazo de

agar con C. elegans vivos a otra caja nueva grande con la bacteria para tener abundantes

organismos con los cuales trabajar.

ACTIVIDAD PROCEDIMIENTO

SEMBRAR BACTERIA OP50-1 Esta bacteria E. coli no patógena es el

alimento de C. elegans. Con la punta azul

de una micropipeta, se le cortaba un

(20)

que se le añadía a las cajas con NGM fuera

más homogénea. Una gota por caja Petri.

FIG. 8: Cajas Petri con NGM + gota de OP50-1.

ACTIVIDAD PROCEDIMIENTO

DESARROLLO DE EXPERIMENTOS Se realizaba el protocolo de mantenimiento

de C. elegans durante la semana para poder

tener suficientes gusanos para hacer

experimentos. Se realizaba el experimento y

los resultados se pasaban a tablas en EXCEL.

Tabla 1: Experimento 19 de Julio (30 minutos a 20®C)

Concentración expuesta + # de C. elegansen placa

Número de respuestas al nosetouch (RTN), 1 siendo un respuesta normal de C. elegans al toque a la nariz y 0 siendo respuesta defectuosa al toque de nariz

CTRL nosetouch1 nosetouch2 nosetouch3 nosetouch4 nosetouch5

1 1 1 1 1 1 100

2 1 1 1 1 1 100

3 1 1 1 1 1 100

4 1 1 1 1 1 100

5 1 1 1 1 1 100

(21)

0.5mM H2O2 nosetouch1 nosetouch2 nosetouch3 nosetouch4 nosetouch5

1 1 1 1 0 1 80

2 0 0 0 0 1 20

3 0 0 0 1 1 40

4 0 0 0 1 1 40

5 1 1 1 1 1 100

6 1 1 1 1 1 100

7 0 0 1 1 1 60

8 0 0 0 0 0 0

55

0.5mM H2O2 + 100µM GABA nosetouch1 nosetouch2 nosetouch3 nosetouch4 nosetouch5

1 1 1 1 1 1 100

2 1 1 1 1 1 100

3 0 0 0 0 1 20

4 1 1 1 1 1 100

5 0 0 1 1 1 60

6 1 1 1 1 1 100

80

0.5mM H2O2 + 100µM CURCUMINA

nosetouch1 nosetouch2 nosetouch3 nosetouch4 nosetouch5

1 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 1 20

4 0

5 0 0 0 1 1 40

6 1 1 1 1 1 100

7 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0 0

10 0

11 0

12 1 1 1 0 0 60

13 1 1 1 1 1 100

14 0 0 0 1 1 40

15 1 1 1 1 1 100

16 1 1 1 1 1 100

17 1 1 1 1 1 100

18 1 1 1 1 1 100

(22)

20 0 0 1 1 1 60

21 0 0 0 0 1 20

22 1 1 1 1 1 100

23 0 0 0 0 0 0

45.2173913

FIG. 9: Tabla posterior muestra experimento realizado con diferentes concentraciones y

fármacos.

A B C

FIG. 10: A muestra todo el material y equipo necesario para los experimentos. B muestra

la placa con pocillos y las cajas Petri utilizadas. C muestra un experimento en curso.

Actividades Complementarias

ACTIVIDAD PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE MEDIO NGM Este medio sirve como crecimiento de la

(23)

PREPARACIÓN DE MEDIO M9 Solución isotónica que disuelve el fármaco

y ayuda a que C. elegans no se hinche.

PREPARAR AGUA OXIGENADA Se preparaba agua oxigenada a diferentes

concentraciones: 0.1µM, 0.35µM y 0.5mM

PREPARAR SOLUCIÓN GABA Se preparaba solución GABA a 100µM para

los experimentos.

PREPARAR SOLUCIÓN DE CURCUMINA Se preparaba solución de curcumina a

100µM para los experimentos.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AÑADIDAS Soluciones de colesterol y estreptomicina

que se añaden a medio M9 y NGM.

REALIZACIÓN DE EXPERIMENTOS Se realizaba el protocolo de mantenimiento

de C. elegans durante la semana para

poder tener suficientes gusanos para hacer

experimentos. Se realizaba el experimento

y los resultados se pasaban a gráficas en

EXCEL.

LAVADO DE MATERIAL Cada que se usaba material

correspondiente para preparación, se

disponía a lavarlos en la tarja

correspondiente para el equipo encargado

de nuestro proyecto.

CHEQUEO DE TEMPERATURA EN

ENCUBADORAS CON C. ELEGANS

Todas las mañanas se mantenía un registro

de las temperaturas correspondientes de

las 2 incubadoras dentro del laboratorio

para tener en buenas condiciones nuestro

modelo animal.

BÚSQUEDAS BIBLIOGRÁFICAS Se tenía a la mano computadoras

disponibles para realizar búsquedas

(24)

PROCEDIMIENTO

El experimento piloto consistió en utilizar placas de 12 pocillos dónde se

introdujeron 15 gusanos en cada pocillo con la ayuda de una herramienta con un asa de

platino delgada y plana (FIG.11:B); 3 pocillos para control, 3 pocillos para H202 a 0.1µM, 3

pocillos para H202 a 0.5µM, y 3 pocillos para H202 a 1µM. Dentro de cada pocillo se le

añadió solución M9 (2ml, 1.99ml, 1.90ml y 1.80ml respectivamente) más lo adicional para

completar a 2ml de H202 (0µL, 10µL, 100µL y 200µL respectivamente). Se incubaron 60

minutos a 20°C y posteriormente se sometían a un lavado con la mini centrífuga, se

retiraba el sobrenadante y se pasaba el pellet a cajas Petri pequeñas donde se dejaban

secar y se observaban al microscopio los C. elegans y se les hacía la conducta RTN, donde

se observaba su respuesta al toque en la cabeza con la punta de una ceja. Se cambiaba el

tiempo de incubación a 30 minutos y 1 hora para observar diferencias, al igual que se

(25)

Después se cambió la concentración de H202 a 0.5mM y se aumentó el número de

gusanos a 30 por pocillo (FIG. 12). Posteriormente el experimento cambió, en placas de 12

pocillos donde se introducían 20 gusanos en cada pocillo, 3 pocillos para control, 3 pocillos

para H202 a 0.5mM, 3 pocillos para H202 a 0.5mM más 100µM de GABA, y 3 pocillos para

H202 a 0.5mM más 100µM de curcumina (FIG.13). Dentro de cada pocillo se le añadió

solución M9 (2ml, 1.90ml, 1.70ml y 1.70ml respectivamente) mas 100µL de H202 y 200µL

de GABA y curcumina. Se incubaron 15 minutos a 20°C y posteriormente se sometían a

lavado como mencionado anteriormente y se les hacia la conducta RTN.

FIG. 12: Efecto de GABA vs H202, a 100µM y 0.35µM/0.5mM respectivamente. A es diagrama de bloques de

(26)

FIG. 13: Efecto de la Curcumina vs H2O2. A es diagrama de bloques de proceso y B es representación gráfica de

proceso.

Se realizaron 11 experimentos con los procedimientos explicados anteriormente.

Fue necesario elaborar varios experimentos para formar una base de datos tomando los

resultados y para observar la tendencia al exponer un fármaco distinto y la reacción de los

C. elegans conforme el efecto oxidativo correspondiente.

La respuesta al toque de nariz (RTN) se evaluaba al tocar el gusano con la punta de

un pelo ceja sobre su cabeza: Si el gusano mostraba una respuesta normal de C. elegans,

es decir, retrocedía al toque, se tomaba como un RTN positivo; si el gusano mostraba una

(27)

RESULTADOS

Se analizó el efecto de 100 µM de GABA y 100 µM de Curcumina en el modelo

animal C. elegans expuesto a 0.35 µM y 0.5 mm de H2O2.

Como se puede observar en las figuras 14 y 15, en ambos casos los animales a los

que se les administró el GABA cuando fueron expuestos a H2O2 mostraron un mejor

desempeño en el ensayo del toque a la nariz, en comparación con los animales que no se

les administro GABA y fueron expuestos a H2O2.

La curcumina no ejerció ningún efecto sobre los animales expuesto a ambas

concentraciones de H2O2.

FIG. 14: Gráficas mostrando el porcentaje de RTN correspondiente a la exposición con GABA y

Curcumina simultáneamente con H2O2. En la primera gráfica sólo en concentración de 0.35µM, la

(28)

FIG. 15: Gráficas mostrando efecto reversible en exposición con GABA a 100µM en ambas

concentraciones de H2O2 (0.35µM y 0.5mM).

El programa correspondiente que se utilizó para realizar las gráficas se llama Sigma

Plot, en este caso, el Dr. Leonardo fue el encargado en recibir nuestros resultados y

(29)

CONCLUSIONES

Los resultados de los protocolos, mostraron que el H202 a concentraciones de 0.35

µM en adelante, indujo un deterioro de la RTN del 39%, un cambio significativo en

relación a los gusanos control.

De esto se infiere que la oxidación induce un deterioro del sistema GABAérgico. La

co-exposición de H202 y GABA revirtió parcialmente este efecto, lo que indica que al

menos en parte, el deterioro es dependiente del receptor GABA.

Por otro lado, 100 µM CUR en co-exposición con H202, no restauró

significativamente el deterioro de la RTN, que era la acción esperada, ya que la curcumina

estaba actuando como nuestro antioxidante.

El efecto oxidativo por parte del H202 si afecta en la actividad del sistema

GABAérgico en el C. elegans, y al exponer al nemátodo con la solución GABA, este nos

revierte el daño oxidativo, causando que la respuesta motora del gusano aparente ser

normal.

RECOMENDACIONES

Prolongar el tiempo de experimentación, cambiar diferentes concentraciones y

tiempos de exposición de fármacos y de H2O2 e intentar cambiar el antioxidante, ya que

quizá la curcumina no sea el antioxidante adecuado para este organismo. Estar a prueba y

error con cada una de estas variables hasta encontrar que se revierta el deterioro y daño

(30)

FUENTES DE CONSULTA

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(33)

ANEXOS

MEDIO NGM-LITE

 Preparación de 100 ml de agua destilada.

 0.2 gramos NaCl

 0.4 gramos de Bactoriptona

 0.3 gramos de KH2PO4 monobásico

 0.05 gramos de K2HPO4V bibásico

 2 gramos de agar Disco bacto-agar

Se mezcla lo anterior, se agita en temperatura alta para homogenizar por 15 minutos.

Posteriormente se introduce a la autoclave 25 minutos para esterilizar. Después, se

esterilizó el ambiente, y se añaden 100µl de colesterol líquido y 4µl de estreptomicina y se

agita manualmente para homogeneizar. Se toman 20 ml de medio y se depositan en cajas

Petri y se espera a solidificar.

MEDIO LB

 25 ml agua destilada

 0.25 gramos de bactotriptona

 0.13 gramos de extracto de levadura

 0.25 gramos NaCl

Se agita manualmente y se introduce a autoclave por 25 minutos para esterilizar.

Posteriormente, se le agregan 25µl de estreptomicina y 500µl de OP50-1 y se puso en el

shaker durante toda la noche. Al día siguiente se revisa para observar turbidez, ya que

(34)

MEDIO M9

 100ml agua destilada

 0.3 gramos KH2PO4 (fosfato de potasio monobásico)

 0.6 gramos NA2HPO4 (fosfato de sodio bibásico)

 0.5 gramos NaCl

Se agita manualmente y se introduce a la autoclave por 25 minutos. Mientras se

esteriliza, se prepara una solución con 3ml de agua destilada con 0.36 gramos de sulfato

de magnesio (MgSO4), se agitó con bala hasta disolverse por completo. Posteriormente de

la esterilización, se retira de la autoclave, se añade la solución de MgSO4, se homogeniza y

se introduce a tubos falcón y se refrigera.

SOLUCIÓN PERÓXIDO DE HIDRÓGENO

 3% molaridad que muestra en el empaque.

(

) = 0.8823 mol/lt = 0.88 M

V1= ( )( )( ) = 0.0566ml

0.0566ml ( )= 56.67µl de H2O2

Entonces, para 10Mm:

5ml de m9 + 56.67µM de H2O2

Para 0.5mM:

Figure

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Referencias